Plasmide CRISPR d'Activation (h) GlyR α2: sc-402179-ACT

GLRA2 code la sous-unité alpha-2 du récepteur humain à la glycine (GlyR α2), un canal chlorure ligand‑dépendant qui assure une neurotransmission inhibitrice rapide dans le système nerveux central. Après liaison de la glycine, GlyR α2 favorise l’entrée de chlorure et l’hyperpolarisation de la membrane, modulant l’excitabilité neuronale et la signalisation synaptique au cours du développement comme dans les circuits matures. Des altérations liées à GLRA2 ont été associées à des phénotypes neurodéveloppementaux et à des troubles liés aux crises, soulignant l’importance de la signalisation glycinergique dans le maintien du tonus inhibiteur. Ce récepteur s’interface fonctionnellement avec des réseaux de neurotransmetteurs plus larges et avec des processus d’homéostasie ionique qui régulent la maturation des circuits et l’équilibre excitation–inhibition.

GlyR α2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GLRA2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GlyR α2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GLRA2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GLRA2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GlyR α2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GLRA2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GlyR α2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GlyR α2 dans les cellules tumorales présentant une expression de GLRA2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.