glypican-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405200-ACT

Il GPC4 umano codifica la glicano-4, un proteoglicano a eparan solfato ancorato al glicosilfosfatidilinositolo (GPI) che organizza le interazioni tra la superficie cellulare e la matrice extracellulare legandosi a fattori di crescita, morfogeni e chemochine. Attraverso le sue catene di eparan solfato, la glicano-4 può influenzare la disponibilità dei ligandi e l’interazione con i recettori in vie di segnalazione tra cui Wnt/β-catenina, FGF, BMP e Hedgehog, modulando così proliferazione cellulare, differenziamento e patterning tissutale. Nella ricerca biomedica, le alterazioni della segnalazione mediata dalle glicane e il rimodellamento della matrice extracellulare sono spesso studiati in contesti quali disturbi dello sviluppo, fibrosi, regolazione metabolica e biologia tumorale, dove variazioni nella segnalazione mediata dai proteoglicani possono rimodellare i fenotipi cellulari.

glypican-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPC4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

glypican-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPC4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPC4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di glypican-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPC4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da glypican-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via glypican-4 nelle cellule tumorali con espressione di GPC4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.