GLULD1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409944-ACT

Il gene umano LGSN codifica GLULD1 (noto anche come lengsin), una proteina arricchita nel cristallino implicata nel mantenimento dell’omeostasi delle proteine crystallin e dell’architettura cellulare durante la differenziazione delle cellule fibrose del cristallino. Studi funzionali collegano LGSN/GLULD1 all’organizzazione del citoscheletro e ai processi di proteostasi che sostengono la trasparenza e la resistenza all’aggregazione nei tessuti oculari. Un’espressione alterata o una disfunzione dei fattori di mantenimento strutturale del cristallino è rilevante per la biologia della cataratta e per altri disturbi caratterizzati da misfolding proteico e compromissione dell’integrità del cristallino. Queste caratteristiche rendono LGSN un bersaglio utile per indagare programmi di differenziazione tessuto-specifici e risposte allo stress che influenzano la stabilità del proteoma.

GLULD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LGSN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GLULD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LGSN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LGSN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GLULD1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LGSN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GLULD1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GLULD1 nelle cellule tumorali con espressione di LGSN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.