GLULD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409944-ACT

Das humane LGSN kodiert GLULD1 (auch als Lengsin bekannt), ein in der Linse angereichertes Protein, das an der Aufrechterhaltung der Homöostase von Kristallin-Proteinen und der zellulären Architektur während der Differenzierung von Linsenfaserzellen beteiligt ist. Funktionelle Studien bringen LGSN/GLULD1 mit der Organisation des Zytoskeletts und mit Proteostase-Prozessen in Verbindung, die Transparenz und Aggregationsresistenz in okulären Geweben unterstützen. Veränderte Expression oder Funktionsstörungen von Faktoren, die die strukturelle Integrität der Linse erhalten, sind relevant für die Kataraktbiologie und andere Erkrankungen, die durch Proteinfehlfaltung und eine beeinträchtigte Linsenintegrität gekennzeichnet sind. Diese Eigenschaften machen LGSN zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung gewebespezifischer Differenzierungsprogramme und Stressantworten, die die Stabilität des Proteoms beeinflussen.

GLULD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LGSN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GLULD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LGSN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LGSN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GLULD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LGSN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GLULD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GLULD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LGSN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.