Gfi-1B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403883-ACT

GFI1B kodiert den Transkriptionsrepressor Gfi-1B, ein Zinkfingerprotein, das für die hämatopoetische Entwicklung und die Festlegung von Zelllinien essenziell ist – insbesondere in erythroiden und megakaryozytären Programmen. Über Interaktionen mit chromatinmodifizierenden Komplexen wie LSD1/RCOR/HDAC formt Gfi-1B Transkriptionsnetzwerke, die Proliferation, Differenzierung und Reifung von Vorläuferzellen steuern. Seine Aktivität ist in zentrale hämatopoetische Regulatoren eingebettet und kontrolliert Genexpressionsprogramme, die an der Thrombozytenbildung und der Entwicklung roter Blutkörperchen beteiligt sind. Eine dysregulierte GFI1B-Expression oder -Funktion wurde mit erblichen Thrombozytenstörungen sowie mit weiter gefassten Störungen der hämatopoetischen Homöostase in Verbindung gebracht, die für die Forschung zu malignen Bluterkrankungen relevant sind.

Gfi-1B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GFI1B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Gfi-1B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GFI1B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GFI1B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Gfi-1B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GFI1B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Gfi-1B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Gfi-1B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GFI1B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.