Plásmido CRISPR de Activación (h) Get4: sc-407595-ACT

El gen humano GET4 codifica Get4, un componente conservado de la vía TRC/GET que sostiene la proteostasis al coordinar el manejo postraduccional y la inserción en membrana de proteínas ancladas por cola. Get4 interactúa con módulos de cocaperonas y socios como BAG6/SGTA y TRC40/ASNA1 para clasificar clientes hidrofóbicos, ayudando a dirigirlos hacia el retículo endoplásmico o hacia la degradación por control de calidad. A través de su función en la biogénesis de proteínas ancladas por cola, GET4 influye en la homeostasis del RE, el tráfico de membranas y las respuestas celulares al estrés, que con frecuencia se ven alteradas en el cáncer y en los desequilibrios de proteostasis asociados a la neurodegeneración. Por lo tanto, la actividad alterada de GET4 puede ser relevante para estudiar vías vinculadas a la agregación proteica, la señalización de estrés del RE y el recambio mediado por ubiquitina.

Get4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GET4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Get4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GET4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GET4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Get4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GET4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Get4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Get4 en células tumorales con expresión de GET4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.