Gemin3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403271-ACT

Das humane Gen **DDX20** kodiert **Gemin3**, eine ATP-abhängige DEAD-Box-RNA-Helikase, die als zentrale Komponente des **SMN–Gemin-Komplexes** und des Assemblierungswegs für spliceosomale **snRNPs** fungiert. Gemin3 ist an der RNA-Metabolisierung beteiligt, indem es Ribonukleoprotein-Komplexe umbaut und damit das **pre-mRNA-Spleißen**, die **snRNA-Reifung** sowie eine breitere **posttranskriptionelle Genregulation** unterstützt. Über Interaktionen mit **SMN** und anderen Gemin-Proteinen trägt es dazu bei, die **Fidelität der RNA-Prozessierung** und die **Proteostase** in Zellkern und Zytoplasma aufrechtzuerhalten. Eine Fehlregulation von DDX20/Gemin3-assoziierten RNA-Prozessierungsprogrammen wurde mit veränderten Transkriptionsnetzwerken und krankheitsrelevanten Phänotypen in Modellen der neuromuskulären Biologie und der Krebsbiologie in Verbindung gebracht.

Gemin3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DDX20-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Gemin3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DDX20-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DDX20-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Gemin3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DDX20-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Gemin3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Gemin3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DDX20-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.