Plasmide CRISPR d'Activation (h) GCS-α-2: sc-404305-ACT

GUCY1A2 code la sous-unité α2 de la guanylate cyclase soluble, un récepteur hétérodimérique de l’oxyde nitrique (NO) qui catalyse la conversion du GTP en GMPc. Via une signalisation dépendante du GMPc, la GCS-α-2 contribue à la régulation du tonus du muscle lisse vasculaire, de la fonction plaquettaire et de la signalisation neuronale, en intégrant la production de NO à l’activité en aval de la PKG ainsi qu’au renouvellement du GMPc contrôlé par les phosphodiestérases. Une altération de la signalisation NO–sGC–GMPc est impliquée dans la physiologie cardiovasculaire et métabolique et est fréquemment étudiée dans des contextes tels que le dysfonctionnement endothélial, une vasoréactivité diminuée et des réponses inflammatoires dérégulées. L’expression de GUCY1A2 et sa stœchiométrie avec les sous-unités β peuvent moduler la sensibilité cellulaire au NO et au stress oxydatif, ce qui en fait un nœud utile pour disséquer la dynamique de la voie du GMPc.

GCS-α-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GUCY1A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GCS-α-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GUCY1A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GUCY1A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GCS-α-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GUCY1A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GCS-α-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GCS-α-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de GUCY1A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.