GAP1-InsP₄ BP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403002-ACT

RASA3 codifica per la proteina Ras GTPasi-attivante GAP1-InsP4 BP, un fattore regolatorio che accelera l’idrolisi del GTP sulle piccole GTPasi della famiglia Ras, modulando ampiezza e durata del segnale. Grazie alla sua sensibilità ai polifosfati dell’inositolo, GAP1-InsP4 BP integra segnali di secondi messaggeri legati ai fosfoinositidi con vie dipendenti da Ras che controllano proliferazione, differenziamento, dinamica del citoscheletro e traffico vescicolare. L’attività di RASA3 è implicata nella biologia ematopoietica e vascolare, dove un’alterata regolazione delle piccole GTPasi può perturbare la funzione piastrinica, la segnalazione endoteliale e i programmi di sviluppo. La deregolazione del controllo della via di Ras è ampiamente rilevante per la segnalazione oncogenica e per altri disturbi caratterizzati da un’attività aberrante delle reti MAPK/PI3K, rendendo RASA3 un nodo utile per studi meccanicistici della trasduzione del segnale.

GAP1-InsP4 BP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RASA3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GAP1-InsP4 BP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RASA3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RASA3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GAP1-InsP4 BP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RASA3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GAP1-InsP4 BP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GAP1-InsP4 BP nelle cellule tumorali con espressione di RASA3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.