Plásmido CRISPR de Activación (h) GAP1-InsP₄ BP: sc-403002-ACT

RASA3 codifica la proteína activadora de la GTPasa Ras GAP1-InsP4 BP, un factor regulador que acelera la hidrólisis de GTP en pequeñas GTPasas de la familia Ras para modular la amplitud y la duración de la señal. Gracias a su capacidad de responder a los polifosfatos de inositol, GAP1-InsP4 BP integra señales de segundos mensajeros vinculadas a fosfoinosítidos con vías dependientes de Ras que controlan la proliferación, la diferenciación, la dinámica del citoesqueleto y el tráfico vesicular. La actividad de RASA3 está implicada en la biología hematopoyética y vascular, donde una regulación alterada de las pequeñas GTPasas puede perturbar la función plaquetaria, la señalización endotelial y programas del desarrollo. La desregulación del control de la vía de Ras es ampliamente relevante para la señalización oncogénica y otros trastornos caracterizados por una actividad aberrante de las redes MAPK/PI3K, lo que convierte a RASA3 en un nodo útil para estudios mecanísticos de transducción de señales.

GAP1-InsP4 BP El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RASA3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GAP1-InsP4 BP El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RASA3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RASA3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GAP1-InsP4 BP. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RASA3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GAP1-InsP4 BP en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GAP1-InsP4 BP en células tumorales con expresión de RASA3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.