Gads CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402831-ACT

GRAP2 codiert das Adapterprotein Gads, ein hämatopoetisches Signalgerüst, das phosphoryliertes LAT mit SLP-76 verbindet und so den T‑Zell‑Rezeptor(TCR)-Signalosom-Komplex zusammenbaut. Über seine SH2- und SH3-Domänen koordiniert Gads die Rekrutierung von Effektor-Komplexen, die die Aktivierung von PLCγ1, Calciumfluss, MAPK-Signalübertragung sowie nachgeschaltete Transkriptionsprogramme fördern, welche die T‑Zell‑Aktivierung, -Differenzierung und Zytokinproduktion steuern. Die GRAP2-Funktion ist auch für die Immunrezeptor-Signalübertragung in anderen Leukozytenlinien relevant und beeinflusst die Zytoskelett-Remodellierung sowie die Bildung der immunologischen Synapse. Eine fehlregulierte GRAP2/Gads-abhängige Signalgebung wurde mit veränderten Immunantworten in Verbindung gebracht und wird in Zusammenhängen wie Immundefizienz, autoimmunitätsbezogenen Mechanismen und Signalnetzwerken hämatologischer Malignome untersucht.

Gads Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GRAP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Gads Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GRAP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GRAP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Gads-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GRAP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Gads-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Gads-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GRAP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.