GAD-67 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400588-ACT

GAD1 kodiert die Glutamatdecarboxylase 67 (GAD-67), ein pyridoxalphosphatabhängiges Enzym, das die Umwandlung von L-Glutamat zu γ-Aminobuttersäure (GABA) katalysiert und damit die inhibitorische Neurotransmission sowie das Erregungs-Hemmungs-Gleichgewicht im menschlichen zentralen Nervensystem unterstützt. GAD-67 trägt zu den zytosolischen GABA-Pools in GABAergen Interneuronen bei und steht in Zusammenhang mit synaptischer Funktion, neuronalen Netzwerkoszillationen und aktivitätsabhängiger metabolischer Kopplung. Eine veränderte Expression von GAD1/GAD-67 wurde mit der gestörten GABAergen Signalübertragung in mehreren neuropsychiatrischen und neuroentwicklungsbedingten Erkrankungen in Verbindung gebracht, was GAD1 zu einem zentralen Ziel für mechanistische Studien macht. Die experimentelle Modulation von GAD1 wird häufig eingesetzt, um die Physiologie inhibitorischer Schaltkreise, die Neurotransmitterhomöostase und die transkriptionelle Regulation in neuronalen Modellen zu untersuchen.

GAD-67 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GAD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GAD-67 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GAD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GAD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GAD-67-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GAD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GAD-67-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GAD-67-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GAD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.