Gab 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401108-ACT

Das humane GAB1 kodiert Gab1, ein Gerüst-/Adapterprotein, das Signale von Rezeptor-Tyrosinkinasen und Zytokinrezeptoren integriert, um nachgeschaltete Signalkaskaden zu koordinieren, die Proliferation, Überleben, Migration und Differenzierung steuern. Nach Tyrosinphosphorylierung rekrutiert Gab1 SH2-Domänen-Effektoren wie PTPN11/SHP2 und die p85-Untereinheit der PI3K und verknüpft so vorgeschaltete Rezeptoren mit der MAPK/ERK- und der PI3K–AKT-Signalübertragung sowie mit damit verbundenen Prozessen des Zytoskeletts und des vesikulären Transports. Gab1-abhängige Signalgebung trägt zur Regulation der epithelialen Morphogenese, der Aktivierung von Immunzellen und von Wachstumsfaktorantworten bei. Eine fehlregulierte GAB1-Expression oder -Phosphorylierung wurde mit dem aberranten Output von RTK-Signalwegen in zahlreichen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, was seine Nutzung als mechanistischer Knotenpunkt in Signalweg- und Netzwerkstudien unterstützt.

Gab 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GAB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Gab 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GAB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GAB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Gab 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GAB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Gab 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Gab 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GAB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.