Plasmide CRISPR d'Activation (h) G6PT: sc-406483-ACT

SLC37A4 humain code le transporteur de glucose-6-phosphate (G6PT), une protéine membranaire du réticulum endoplasmique (RE) qui importe le glucose-6-phosphate dans la lumière du RE afin de soutenir l’activité de la glucose-6-phosphatase et l’homéostasie métabolique. Cette étape de transport est au cœur de la glycogénolyse et de la néoglucogenèse, en reliant le flux glucidique cytosolique à la gestion du phosphate localisée dans le RE et aux voies de production de glucose. La fonction de G6PT influence l’équilibre énergétique intracellulaire et les réponses cellulaires à la disponibilité des nutriments, avec des effets en aval sur le métabolisme des neutrophiles et du foie. Des variants pathogènes de SLC37A4 sont associés à la glycogénose de type Ib, ce qui rend ce locus pertinent pour des études mécanistiques de la dérégulation métabolique et de phénotypes liés à l’immunité.

G6PT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC37A4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

G6PT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC37A4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC37A4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de G6PT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC37A4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de G6PT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie G6PT dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC37A4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.