G6Pase-β CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403320-ACT

G6PC3 kodiert die Glukose-6-Phosphatase Beta (G6Pase-β), eine im endoplasmatischen Retikulum lokalisierte katalytische Untereinheit, die im Rahmen des Glukose-6-Phosphatase-Systems Glukose-6-phosphat zu Glukose und anorganischem Phosphat hydrolysiert. Diese Aktivität trägt zur intrazellulären Glukoseverwertung bei und ist mit dem zentralen Kohlenhydratstoffwechsel sowie der ER-assoziierten Homöostase verknüpft; dadurch beeinflusst sie in zahlreichen Zelltypen den Energiehaushalt und den Redoxzustand. Die Funktion von G6PC3 wurde mit der Regulation der Physiologie myeloischer Zellen und von Stressantworten in Zusammenhang gebracht, und Varianten in diesem Gen sind mit Phänotypen kongenitaler Neutropenie assoziiert. Entsprechend wird G6PC3 häufig in Modellen zur Entwicklung von Immunzellen, zur metabolischen Umprogrammierung und zu ER-abhängigen Signalprozessen untersucht.

G6Pase-β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen G6PC3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

G6Pase-β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des G6PC3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der G6PC3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen G6Pase-β-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native G6PC3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von G6Pase-β-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des G6Pase-β-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem G6PC3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.