Fyn CRISPR Activation Plasmid (m2): sc-420431-ACT-2

Das Mausgen Fyn kodiert eine nichtrezeptorische Tyrosinkinase der Src-Familie, die als proximales Signalknotenprotein downstream von Immunrezeptoren, Integrinen und Wachstumsfaktorrezeptoren fungiert und über phosphorylierungsabhängige Mechanismen die Zytoskelettdynamik, Zelladhäsion, Migration und Proliferation reguliert. In T-Zellen und anderen hämatopoetischen Zelllinien trägt Fyn zur TCR-Signalübertragung und Immunaktivierung bei, unter anderem über MAPK/ERK- und PI3K–AKT-Signalwege sowie durch die Modulation von Phosphatase- und Adapterkomplexen; im Nervensystem beeinflusst es zudem synaptische Signalprozesse und myelinisierungsbezogene Vorgänge. Eine dysregulierte Fyn-Aktivität wurde in Modellsystemen mit veränderten Entzündungsreaktionen, neurodegenerationsassoziierten Signalen und onkogenen Signalnetzwerken in Verbindung gebracht, was Fyn für Studien zur Immunregulation, neuronalen Funktion und Tumorbiologie relevant macht. Die Geneditierung von Maus-Fyn ermöglicht die mechanistische Aufklärung kinaseabhängiger Signalwege, von Phosphorylierungsnetzwerken und zelltypspezifischer Phänotypen in vitro und in vivo.

Fyn Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Fyn-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Fyn Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Fyn-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Fyn-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Fyn-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Fyn-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Fyn-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Fyn-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Fyn-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.