Fumarylacetoacetase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402478-ACT

FAH kodiert die humane Fumarylacetoacetase, ein zytosolisches Enzym, das den letzten Schritt des Tyrosinabbaus katalysiert, indem es Fumarylacetoacetat zu Fumarat und Acetoacetat hydrolysiert. Diese Reaktion verknüpft den Abbau aromatischer Aminosäuren über die Bildung von Vorstufen des TCA-Zyklus und der Ketonkörper mit dem zentralen Kohlenstoffstoffwechsel und hilft, die Anreicherung reaktiver Zwischenprodukte zu verhindern, die zelluläre Makromoleküle verändern können. Eine gestörte FAH-Aktivität ist mit der hereditären Tyrosinämie Typ I assoziiert und wird in experimentellen Kontexten häufig als Modell für metabolischen Stress in Hepatozyten, DNA-Schadensantworten und leberselektive Selektionssysteme eingesetzt. Damit ist FAH ein zentraler Knotenpunkt für die Untersuchung von Stoffwechselfluss, Entgiftungskapazität und Homöostase von Hepatozyten.

Fumarylacetoacetase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FAH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Fumarylacetoacetase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FAH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FAH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Fumarylacetoacetase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FAH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Fumarylacetoacetase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Fumarylacetoacetase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FAH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.