Plásmido CRISPR de Activación (h) FucT-VIII: sc-402957-ACT

FUT8 codifica la alfa-(1,6)-fucosiltransferasa (FucT-VIII), una enzima residente del aparato de Golgi que cataliza la fucosilación del núcleo de los N-glicanos en las glicoproteínas. Esta modificación influye en el plegamiento y la secreción de proteínas, en las interacciones receptor–ligando y en la señalización downstream en diversas rutas moduladas por el estado de glicosilación, incluidas las redes de receptores de factores de crecimiento e inmunitarios. La actividad alterada de FUT8 se ha vinculado a cambios en la adhesión y la migración celular, y se ha asociado con el remodelado desregulado de glicoproteínas observado en biología del cáncer, inflamación y trastornos congénitos de la glicosilación. Por ello, FUT8 se estudia ampliamente en glicobiología, control de calidad de proteínas secretadas y en los mecanismos que conectan el procesamiento de glicanos en el Golgi con la transducción de señales.

FucT-VIII El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FUT8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

FucT-VIII El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FUT8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FUT8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de FucT-VIII. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FUT8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de FucT-VIII en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía FucT-VIII en células tumorales con expresión de FUT8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.