FucT-VIII Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402957-ACT

FUT8 codifica a alfa-(1,6)-fucosiltransferase (FucT-VIII), a enzima residente no aparelho de Golgi que catalisa a fucosilação do núcleo de glicanos N-ligados em glicoproteínas. Essa modificação influencia o dobramento e a secreção de proteínas, as interações receptor–ligante e a sinalização a jusante em vias afetadas pelo estado de glicosilação, incluindo redes de receptores de fatores de crescimento e do sistema imune. Alterações na atividade de FUT8 estão associadas a mudanças na adesão e migração celular e têm sido relacionadas ao remodelamento desregulado de glicoproteínas observado na biologia do câncer, na inflamação e em distúrbios congênitos da glicosilação. Por isso, FUT8 é amplamente estudado em glicobiologia, no controle de qualidade de proteínas secretadas e nos mecanismos que conectam o processamento de glicanos no Golgi à transdução de sinais.

FucT-VIII O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FUT8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FucT-VIII O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FUT8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FUT8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FucT-VIII. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FUT8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FucT-VIII no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FucT-VIII em células tumorais com expressão de FUT8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.