FBXO25 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405092-ACT

FBXO25 umano codifica una proteina F-box che funge da componente di riconoscimento del substrato dei complessi ligasi E3 dell’ubiquitina SCF (SKP1–CUL1–F-box), contribuendo a indirizzare proteine specifiche verso l’ubiquitinazione e il successivo turnover dipendente dal proteasoma. Attraverso una degradazione proteica regolata, FBXO25 contribuisce al controllo della progressione del ciclo cellulare, della segnalazione in risposta allo stress e al mantenimento della proteostasi. L’alterazione della segnalazione dell’ubiquitina mediata da SCF può rimodellare i programmi trascrizionali e l’omeostasi cellulare, collegando un’attività F-box modificata a fenotipi rilevanti per la malattia in oncologia e in neurobiologia. FBXO25 è quindi di interesse per analizzare l’architettura della via ubiquitina–proteasoma e i suoi effetti a valle su segnalazione ed espressione genica.

FBXO25 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FBXO25 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FBXO25 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FBXO25 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FBXO25, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FBXO25. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FBXO25 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FBXO25 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FBXO25 nelle cellule tumorali con espressione di FBXO25 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.