FAT3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404132-ACT

FAT3 kodiert ein großes, atypisches Cadherin, das zur kalziumabhängigen Zell-Zell-Adhäsion beiträgt und die Gewebearchitektur durch die Regulation von Zellpolarität, Migration und Zytoskelettdynamik mitorganisiert. Als Mitglied der FAT-Cadherin-Familie ist FAT3 an kontaktabhängigen Signalprogrammen beteiligt, die sich mit der planaren Zellpolarität sowie mit adhäsionsassoziierten Signalwegen überschneiden, welche Morphogenese und neuronale Musterbildung steuern. Eine veränderte FAT3-Expression oder Störungen seiner Regulation wurden mit Änderungen der Zellmotilität und des Differenzierungszustands in Verbindung gebracht, was FAT3 für die Untersuchung adhäsionsgetriebener Umbauprozesse in Entwicklungs- und Krankheitskontexten relevant macht. In humanen Modellsystemen dient FAT3 als hilfreicher Knotenpunkt, um zu untersuchen, wie membranverankerte Adhäsionsrezeptoren transkriptionelle Outputs und das Zellverhalten beeinflussen.

FAT3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FAT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FAT3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FAT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FAT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FAT3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FAT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FAT3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FAT3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FAT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.