FAT3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404132-ACT

FAT3 codifica una grande caderina atipica che contribuisce all’adesione cellula-cellula dipendente dal calcio e aiuta a organizzare l’architettura tissutale regolando la polarità cellulare, la migrazione e la dinamica del citoscheletro. In quanto membro della famiglia delle caderine FAT, FAT3 è implicata in programmi di segnalazione dipendenti dal contatto che si intersecano con la polarità planare delle cellule e con vie associate all’adesione che controllano la morfogenesi e il patterning neuronale. Alterazioni dell’espressione di FAT3 o perturbazioni della sua regolazione sono state associate a cambiamenti nella motilità cellulare e negli stati di differenziamento, rendendola rilevante per lo studio del rimodellamento guidato dall’adesione in contesti di sviluppo e di malattia. Nei sistemi modello umani, FAT3 rappresenta un nodo utile per indagare come i recettori di adesione ancorati alla membrana influenzino gli output trascrizionali e il comportamento cellulare.

FAT3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FAT3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FAT3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FAT3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FAT3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FAT3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FAT3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FAT3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FAT3 nelle cellule tumorali con espressione di FAT3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.