FANCM CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403495-ACT

Das humane FANCM kodiert eine DNA-Translokase, die im Fanconi-Anämie-(FA)-Signalweg wirkt, um die Genomstabilität bei Replikationsstress aufrechtzuerhalten. FANCM erkennt zum Stillstand gekommene Replikationsgabeln und Interstrang-Quervernetzungen und koordiniert dabei mit dem FA-Core-Komplex, der ATR-abhängigen Checkpoint-Signalübertragung sowie Faktoren der homologen Rekombination, um Gabel-Remodellierung und Reparatur zu fördern. Durch seine Funktionen bei der Passage („traverse“) von Replikationsgabeln, dem Wiederanlaufen der Replikation und der Unterdrückung aberranter Rekombination trägt FANCM dazu bei, Chromosomenbrüche und Mutagenese zu begrenzen. Eine Störung der FANCM-vermittelten Reparatur ist mit einer verminderten Fähigkeit zur Reparatur von Quervernetzungen und mit Genominstabilitäts-Phänotypen verbunden, die für die Biologie der Fanconi-Anämie und krebsassoziierte Veränderungen der DNA-Schadensantwort relevant sind.

FANCM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FANCM-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FANCM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FANCM-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FANCM-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FANCM-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FANCM-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FANCM-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FANCM-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FANCM-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.