Plásmido CRISPR de Activación (h) FANCI: sc-402229-ACT

FANCI codifica un componente clave de la vía de reparación del ADN de la anemia de Fanconi (FA), que protege la integridad del genoma durante el estrés replicativo. Tras un daño por enlaces cruzados interhebra del ADN, FANCI forma el complejo ID con FANCD2, sufre fosforilación reguladora y monoubiquitinación, y coordina el procesamiento nucleolítico con la recombinación homóloga para permitir el reinicio de horquillas de replicación detenidas. Este eje de señalización se integra con el control del punto de control dependiente de ATR y con la reparación acoplada a la replicación para limitar la rotura cromosómica y la formación de micronúcleos. La alteración de la regulación de la vía FA, incluida la disfunción de FANCI, se asocia con síndromes hereditarios de inestabilidad genómica y se estudia ampliamente por su impacto en la sensibilidad al daño del ADN y en la carga mutacional.

FANCI El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FANCI sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

FANCI El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FANCI en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FANCI, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de FANCI. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FANCI y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de FANCI en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía FANCI en células tumorales con expresión de FANCI silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.