Exo84 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403472-ACT

L’EXOC8 umano codifica Exo84, un componente centrale del complesso di ancoraggio esocistico (exocyst) octamerico, che indirizza le vescicole secretorie verso siti definiti della membrana plasmatica prima della fusione mediata dalle SNARE. Attraverso il suo ruolo nell’esocitosi polarizzata, Exo84 sostiene processi quali l’instaurarsi della polarità epiteliale, la crescita dei neuriti, la ciliogenesi e la migrazione cellulare direzionale, e interagisce con la segnalazione di piccole GTPasi (per esempio le vie di Ral e Rab) che coordina il targeting delle vescicole e il rimodellamento del citoscheletro. Il traffico dipendente dall’exocyst influenza anche la consegna alla superficie e il riciclo di recettori e trasportatori, plasmando gli output di segnalazione e la composizione della membrana. Una funzione dell’exocyst deregolata è stata associata a una polarità cellulare alterata e a un comportamento invasivo in modelli di cancro, nonché a difetti dell’omeostasi neuronale ed epiteliale collegati a fenotipi di sviluppo e neurodegenerativi.

Exo84 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EXOC8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Exo84 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EXOC8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EXOC8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Exo84. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EXOC8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Exo84 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Exo84 nelle cellule tumorali con espressione di EXOC8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.