Exo84 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403472-ACT

Das menschliche EXOC8 kodiert Exo84, eine Kernkomponente des oktameren Exocyst-Tethering-Komplexes, der sekretorische Vesikel vor der SNARE-vermittelten Fusion zu definierten Stellen an der Plasmamembran dirigiert. Über seine Rolle in der polarisierten Exozytose unterstützt Exo84 Prozesse wie die Etablierung epithelialer Polarität, Neuritenwachstum, Ziliogenese und gerichtete Zellmigration und ist mit der Signalübertragung kleiner GTPasen (z. B. Ral- und Rab-Wege) verknüpft, die Vesikel-Targeting und zytoskelettales Remodeling koordinieren. Exocyst-abhängiger Transport beeinflusst zudem die Oberflächenanlieferung und das Recycling von Rezeptoren und Transportern und prägt dadurch Signalausgänge sowie die Membranzusammensetzung. Eine fehlregulierte Exocyst-Funktion wurde in Krebsmodellen mit veränderter Zellpolarität und invasivem Verhalten in Verbindung gebracht, ebenso wie mit Störungen der neuronalen und epithelialen Homöostase, die mit Entwicklungs- und neurodegenerativen Phänotypen assoziiert sind.

Exo84 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EXOC8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Exo84 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EXOC8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EXOC8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Exo84-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EXOC8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Exo84-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Exo84-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EXOC8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.