ETEA CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403730-ACT

FAF2 kodiert das im endoplasmatischen Retikulum (ER) ansässige Protein ETEA (auch als UBXD8 bekannt), einen UBX-Domänen-Adaptor, der ubiquitinierte Substrate mit der p97/VCP-ATPase koppelt und so den ER-assoziierten Abbau (ERAD) sowie die Proteostase unterstützt. Durch die koordinierte Extraktion und den Abbau fehlgefalteter oder regulierter ER-Proteine trägt ETEA zur Kopplung an die Unfolded-Protein-Response, zur Organisation von Lipidtröpfchen und zur metabolischen Homöostase bei. Die Aktivität von FAF2/ETEA überschneidet sich mit Ubiquitin-Proteasom-Pathways und der Dynamik von ER–Lipidtröpfchen-Kontakten, die die zelluläre Widerstandsfähigkeit gegenüber Stress beeinflussen. Eine veränderte Regulation von ERAD und des Lipidstoffwechsels wurde mit proteotoxischen Stresszuständen und metabolischen Fehlfunktionen in Verbindung gebracht, was FAF2 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien in diesen Kontexten macht.

ETEA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FAF2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ETEA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FAF2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FAF2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ETEA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FAF2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ETEA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ETEA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FAF2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.