ERF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403877-ACT

ERF (ETS2-Repressorfaktor) ist ein humaner Transkriptionsrepressor der ETS-Familie, der an ETS-Motive bindet und so Genprogramme moduliert, die den Zellzyklusfortschritt, die Differenzierung und die Apoptose steuern. Die ERF-Aktivität wird durch MAPK/ERK-abhängige Phosphorylierung reguliert, die seine subzelluläre Lokalisation und die transkriptionelle Output-Leistung beeinflusst und damit extrazelluläre Wachstumssignale mit der nukleären Kontrolle der Transkription verknüpft. Durch die Begrenzung ETS-getriebener Transkription trägt ERF zur homöostatischen Regulation von Proliferation und Linienfestlegung bei—Prozesse, die im Kontext onkogener Signalgebung häufig gestört sind. Eine Fehlregulation ERF-abhängiger Netzwerke wurde mit veränderter Wachstumsfaktor-Responsivität und aberranten Transkriptionszuständen in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und Entwicklungsstörungen relevant sind.

ERF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ERF-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ERF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ERF-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ERF-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ERF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ERF-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ERF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ERF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ERF-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.