Eps8L3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-413175-ACT

EPS8L3 kodiert Eps8L3, ein Mitglied der EPS8-ähnlichen Familie aktinregulatorischer Proteine, das Signaleingänge mit dem dynamischen Umbau des kortikalen Aktinzytoskeletts verknüpft. Über Interaktionen mit aktinassoziierten Komplexen ist Eps8L3 an der Kontrolle von Membranruffling, Veränderungen der Zellform und der Motilität beteiligt – Prozesse, die Adhäsions- und Migrationsprogramme koordinieren. Diese zytoskelettalen Funktionen verbinden EPS8L3 mit Signalwegen downstream von Rezeptor-Tyrosinkinasen und GTPasen der Rho-Familie, die extrazelluläre Reize mit der Bildung von Zellfortsätzen integrieren. Eine veränderte Regulation der Aktindynamik und des Migrationsverhaltens ist in Modellen der Tumorzellinvasion und Metastasierung breit relevant, wodurch EPS8L3 ein nützliches Ziel für mechanistische Studien zu zytoskelettabhängigen Phänotypen darstellt.

Eps8L3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EPS8L3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Eps8L3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EPS8L3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EPS8L3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Eps8L3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EPS8L3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Eps8L3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Eps8L3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EPS8L3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.