epiplakin 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404271-ACT

EPPK1 kodiert Epiplakin 1, einen großen Zytolinker aus der Plakin-Familie, der mit Keratin-Intermediärfilamenten assoziiert ist und zur Organisation des Zytoskeletts sowie zur mechanischen Stabilität von Epithelien beiträgt. Durch das Gerüstbilden von Filamentnetzwerken beeinflusst Epiplakin Prozesse wie Zelladhäsion, Migration und Stressantworten, die für die epitheliale Homöostase und die Integrität der Barriere zentral sind. Eine veränderte Kopplung des Zytoskeletts und eine gestörte epitheliale Architektur sind häufig an Gewebeschädigung und -remodellierung beteiligt, weshalb EPPK1 ein relevanter Marker für die Untersuchung von Differenzierungszuständen in Epithelien und stressinduzierter Reorganisation ist. Seine Expression und filamentspezifischen Funktionen sind daher in Forschungsfeldern von Interesse, die von Epithelbiologie über entzündungsassoziierte Gewebeschädigung bis hin zur Plastizität von Tumorzellen reichen.

epiplakin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EPPK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

epiplakin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EPPK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EPPK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen epiplakin 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EPPK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von epiplakin 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des epiplakin 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EPPK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.