EphB4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420201-ACT

Mouse *Ephb4* kodiert die Rezeptor-Tyrosinkinase EphB4, ein Mitglied des Ephrin–Eph-Signalsystems, das eine kontaktabhängige Kommunikation zwischen benachbarten Zellen vermittelt. Interaktionen zwischen EphB4 und Ephrin-B2 regulieren die Gefäßentwicklung und das vaskuläre Remodeling, einschließlich der arteriovenösen Spezifikation, der Migration von Endothelzellen und von Leitsignalen während der Gewebemusterung. Nachgeschaltete Signalwege greifen in die Zytoskelettdynamik und Adhäsionsmechanismen ein und beziehen Rho-Familien-GTPasen, PI3K/AKT, MAPK/ERK sowie Fokalkontakt-Signalisierung ein, um Zellpositionierung und Grenzbildung zu beeinflussen. Eine fehlregulierte EphB4-Signalisierung wird mit pathologischer Angiogenese und tumorassoziierten Gefäßphänotypen in Verbindung gebracht und ist damit relevant für mechanistische Studien in der Krebsbiologie, in Entwicklungsmodellen und in der Forschung zur Mikroumgebung.

EphB4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ephb4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EphB4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ephb4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ephb4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EphB4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ephb4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EphB4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EphB4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ephb4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.