Ep-CAM CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400220-ACT

EPCAM kodiert das epitheliale Zelladhäsionsmolekül (Ep-CAM), ein transmembranäres Glykoprotein, das homophile Zell-Zell-Adhäsion vermittelt und zur Organisation der epithelialen Integrität, Polarität und Signalübertragung an Zellkontakten beiträgt. Über seine Adhäsionsfunktion hinaus ist Ep-CAM an der regulierten intramembranären Proteolyse und nachgeschalteten Transkriptionsprogrammen beteiligt, die mit Proliferations- und Differenzierungswegen verknüpft sind, einschließlich Crosstalk mit Wnt/β-Catenin-assoziierten Netzwerken. Eine veränderte EPCAM-Expression oder -Lokalisation wird häufig in der Biologie epithelialer Tumoren, in metastaseassoziierten Phänotypen und in Modellen der epithelial-mesenchymalen Transition untersucht; zudem sind Loss-of-Function-Varianten von EPCAM mit angeborenen Darmerkrankungen wie der Tufting-Enteropathie assoziiert. Als Oberflächenantigen und Linienmarker wird Ep-CAM außerdem breit eingesetzt, um epitheliale Subpopulationen zu definieren und Zellzustandsübergänge in Entwicklungs- und krankheitsrelevanten Systemen zu untersuchen.

Ep-CAM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EPCAM-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ep-CAM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EPCAM-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EPCAM-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ep-CAM-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EPCAM-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ep-CAM-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ep-CAM-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EPCAM-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.