EMP-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420165-ACT

Il gene murino Emp1 codifica la proteina di membrana epiteliale 1 (EMP-1), una proteina tetraspan associata alla membrana implicata nella regolazione dell’adesione cellula-cellula, della differenziazione epiteliale e della segnalazione legata alla funzione di barriera. EMP-1 è stata collegata alla modulazione della segnalazione recettoriale e dell’organizzazione del citoscheletro, che influenzano proliferazione, migrazione e risposte allo stress, con ruoli dipendenti dal contesto nei diversi aspetti dell’omeostasi tissutale. Pattern di espressione alterati di EMP1 sono stati riportati in contesti infiammatori e fibrotici e in molteplici fenotipi associati al cancro, dove possono correlare con cambiamenti nell’invasività e nella plasticità cellulare. Queste caratteristiche rendono Emp1 un nodo utile per studiare programmi di segnalazione prossimali alla membrana che collegano segnali extracellulari a esiti trascrizionali e fenotipici.

EMP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Emp1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EMP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Emp1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Emp1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EMP-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Emp1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EMP-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EMP-1 nelle cellule tumorali con espressione di Emp1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.