eIF4AIII CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402660-ACT

EIF4A3 kodiert eIF4AIII, eine DEAD-Box-RNA-Helikase, die als zentraler Bestandteil des Exon-Junction-Complex (EJC) fungiert, der auf gespleißten mRNAs abgelagert wird. eIF4AIII koordiniert die posttranskriptionelle Genregulation, indem es das prä‑mRNA-Spleißen mit mRNA-Export, -Lokalisierung, Kontrolle der Translation und dem nonsense-mediated mRNA decay (NMD) koppelt und damit die Genauigkeit des Transkriptoms sowie die Proteostase mitprägt. Über seine Funktionen in der RNA-Überwachung und der spleißabhängigen Qualitätskontrolle beeinflusst EIF4A3 Signalwege, die mit Zellzyklusprogression, Genomstabilität und Stressantworten verknüpft sind. Eine Fehlregulation der EJC-Aktivität und des NMD wurde mit aberranter Isoformnutzung und veränderter Expression onkogener und neuroentwicklungsbezogener Gennetzwerke in Verbindung gebracht, wodurch EIF4A3 ein relevanter Knotenpunkt für mechanistische Studien zu Defekten der RNA-Prozessierung ist.

eIF4AIII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EIF4A3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

eIF4AIII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EIF4A3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EIF4A3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen eIF4AIII-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EIF4A3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von eIF4AIII-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des eIF4AIII-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EIF4A3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.