Plasmide CRISPR d'Activation (h2) EHD3: sc-404685-ACT-2

L’EHD3 humain (protéine 3 contenant un domaine EH) est une ATPase de la famille EHD qui régule le recyclage endocytique et la tubulation membranaire, en coordonnant le trafic depuis les endosomes précoces vers les endosomes de recyclage puis de retour vers la membrane plasmique. En interagissant avec des effecteurs de Rab et des partenaires associés aux membranes, EHD3 influence l’internalisation et le recyclage des récepteurs, la scission des vésicules, ainsi que l’organisation spatiale de plateformes de signalisation qui façonnent la polarité cellulaire et la migration. Une expression altérée d’EHD3 a été associée à une dérégulation des programmes de transport endosomal observée en cancérologie et dans des contextes neurologiques où le recyclage membranaire affecte la fonction synaptique et l’homéostasie cellulaire. L’édition du gène EHD3 dans des modèles cellulaires humains permet des études mécanistiques du trafic endosome‑membrane, des choix de destin des récepteurs et des conséquences en aval sur la signalisation, à l’aide de l’imagerie, de la protéomique et d’essais fonctionnels de la dynamique vésiculaire.

EHD3 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EHD3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EHD3 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EHD3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EHD3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EHD3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EHD3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EHD3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EHD3 dans les cellules tumorales présentant une expression de EHD3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.