EDEM3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408476-ACT

EDEM3 (ER-Degradations-verstärkendes alpha-Mannosidase-ähnliches Protein 3) ist eine im ER lokalisierte Komponente der Qualitätskontrolle von Glykoproteinen, die an der ER-assoziierten Degradation (ERAD) beteiligt ist, indem sie die demannosylierungsabhängige Erkennung und Beseitigung fehlgefalteter N-Glykoproteine fördert. Durch die Beeinflussung der Unfolded-Protein-Response, der Proteostase und der Integrität des sekretorischen Wegs trägt EDEM3 zur Regulation der zellulären Stressanpassung und zum Abbau aberranter Zielproteine bei. Störungen von ERAD und ER-Proteostase sind in der Krankheitsbiologie breit relevant, auch in Kontexten, in denen chronischer ER-Stress, veränderte Glykank Prozessierung und eine dysregulierte Proteindegradation zur Pathogenese beitragen. Das humane EDEM3 stellt daher einen nützlichen Knotenpunkt dar, um die Schaltkreise der ER-Qualitätskontrolle und die Homöostase des sekretorischen Wegs in mechanistischen und funktionellen Genomik-Workflows zu untersuchen.

EDEM3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EDEM3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EDEM3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EDEM3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EDEM3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EDEM3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EDEM3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EDEM3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EDEM3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EDEM3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.