EBP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402177-ACT

PA2G4 kodiert das ErbB3-bindende Protein 1 (EBP1), einen multifunktionalen RNA- und proteinbindenden Faktor, der mit der Koordination transkriptioneller und translationaler Programme in Verbindung gebracht wird, welche den Zellzyklusverlauf und die zelluläre Differenzierung beeinflussen. EBP1 ist mit der Signalübertragung über ErbB-Rezeptoren assoziiert und beteiligt sich an der Regulation der Genexpression durch Interaktionen mit chromatin- und ribonukleoproteingekoppelten Prozessen; dadurch beeinflusst es Signalwege, die Proliferation und Stressantworten steuern. Veränderte PA2G4/EBP1-Expression oder -Aktivität wurde im Kontext onkogener Signalnetzwerke untersucht, einschließlich Veränderungen in wachstumsfaktorabhängigen transkriptionellen Outputs. Diese Eigenschaften machen PA2G4 zu einem nützlichen Knotenpunkt, um zu untersuchen, wie rezeptorgetriebene Signale in menschlichen Zellen mit der Kontrolle der Genexpression verknüpft werden.

EBP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PA2G4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EBP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PA2G4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PA2G4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EBP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PA2G4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EBP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EBP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PA2G4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.