E2F-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400880-ACT

E2F2 kodiert den humanen Transkriptionsfaktor E2F-2, einen zentralen Regulator des Zellzyklus-Fortschreitens und des G1/S-Übergangs, der die Expression von Genen koordiniert, die für die DNA-Replikation und den Eintritt in die Mitose erforderlich sind. Die Aktivität von E2F-2 wird streng durch Proteine der RB-Familie kontrolliert und integriert Signale, die Proliferation, Checkpoint-Kontrolle und Differenzierung beeinflussen. Eine dysregulierte E2F2-Expression oder Störungen in der vorgelagerten RB/E2F-Signalkaskade sind häufig mit aberranten Zellzyklus-Genprogrammen assoziiert, wie sie in zahlreichen Tumorkontexten und proliferativen Erkrankungen beobachtet werden. Als nuklearer Transkriptionsregulator wird E2F-2 zudem genutzt, um die Architektur transkriptioneller Netzwerke, Replikationsstress-Antworten und linien-/gewebespezifische Wachstumskontrolle zu untersuchen.

E2F-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen E2F2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

E2F-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des E2F2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der E2F2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen E2F-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native E2F2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von E2F-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des E2F-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem E2F2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.