DR3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403461-ACT

TNFRSF25 kodiert den Todesrezeptor 3 (DR3), ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Superfamilie, das überwiegend in Subpopulationen von Immunzellen exprimiert wird und dort die Aktivierung, das Überleben und die Zytokinproduktion von Lymphozyten moduliert. DR3 wird durch TNFSF15 (TL1A) aktiviert und löst eine rezeptornahe Signalweiterleitung aus, die in NF-κB- und MAPK-Signalwegen zusammenlaufen kann und so inflammatorische Genprogramme sowie Effektor-Funktionen von T-Zellen prägt. Über seine Death-Domain kann DR3 zudem kontextabhängig mit Signalproteinkomplexen interagieren, die mit Apoptose und Nekroptose assoziiert sind, und damit Immunaktivierung mit reguliertem Zelltod verknüpfen. Eine Fehlregulation der TL1A–DR3-Signalgebung wurde mit immunvermittelten Entzündungen und Gewebeumbau in Verbindung gebracht, wodurch TNFRSF25 einen nützlichen Ansatzpunkt zur Untersuchung von Mechanismen chronisch-entzündlicher Pathologien und der Immunhomöostase darstellt.

DR3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNFRSF25-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DR3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNFRSF25-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNFRSF25-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DR3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNFRSF25-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DR3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DR3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNFRSF25-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.