DOT1L1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403286-ACT

Das humane DOT1L (DOT1L1) kodiert eine Histon-Lysin-Methyltransferase, die die Mono-, Di- und Trimethylierung von H3K79 katalysiert – eine epigenetische Markierung, die mit aktiver Transkription innerhalb von Genkörpern verknüpft ist. Eine DOT1L-abhängige Chromatinregulation unterstützt die Elongation durch RNA-Polymerase II, die Enhancer-Promotor-Kommunikation sowie die Kopplung der DNA-Schadenssignalgebung an den Zellzyklusfortschritt. Über die Kontrolle linienspezifischer Transkriptionsprogramme beeinflusst DOT1L die hämatopoetische Differenzierung und umfassendere Entwicklungs-Gennetzwerke. Eine dysregulierte DOT1L-Aktivität und veränderte H3K79-Methylierungszustände stehen mit der in Leukämien und anderen Krebserkrankungen beobachteten fehlerhaften Transkriptionsverdrahtung in Zusammenhang, ebenso wie mit kontextabhängigen Effekten auf die Genomstabilität.

DOT1L1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DOT1L-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DOT1L1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DOT1L-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DOT1L-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DOT1L1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DOT1L-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DOT1L1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DOT1L1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DOT1L-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.