DOCK 7 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-426491-ACT

Dock7 kodiert DOCK7, einen atypischen Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, der bevorzugt Rho-Familien-GTPasen wie RAC1 und CDC42 aktiviert, um den Umbau des Aktin-Zytoskeletts, die Zellpolarität und die gerichtete Migration zu koordinieren. Im Nervensystem der Maus trägt DOCK7 über Signalnetzwerke, die Membransignale mit der Zytoskelettdynamik koppeln, zur neuronalen Differenzierung, zum Axonwachstum und zur Biologie der Schwann-Zellen bei. Diese Funktionen verorten DOCK7 in Signalwegen, die das Neuritenauswachsen und die Myelinisierung steuern, mit breiterer Bedeutung für die Entwicklungsneurobiologie und Programme der zellulären Motilität. Eine veränderte DOCK7-Aktivität wurde mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht und in Kontexten untersucht, in denen eine fehlregulierte Rho-GTPase-Signalgebung die Gewebemorphogenese und die Bildung neuronaler Schaltkreise beeinflusst.

DOCK 7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Dock7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DOCK 7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Dock7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Dock7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DOCK 7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Dock7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DOCK 7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DOCK 7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Dock7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.