DOCK 180 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401387-ACT

Humanes DOCK1 (DOCK180) ist ein atypischer Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, der Rac-Familien-GTPasen aktiviert, um den Umbau des Aktinzytoskeletts, die Zelladhäsion und die gerichtete Migration zu koordinieren. Über Signal-Knotenpunkte stromabwärts von Integrinen, Rezeptor-Tyrosinkinasen und Chemokinrezeptoren unterstützt DOCK180 Prozesse wie die Bildung von Lamellipodien, Makropinozytose und die Aufnahme apoptotischer Zellen. DOCK1-abhängige Rac-Signalisierung ist mit Signalwegen verknüpft, die epithelial-mesenchymale Transitionen, invasionsassoziierte Motilitätsprogramme und das Trafficking angeborener Immunzellen regulieren. Eine dysregulierte DOCK1-Aktivität oder -Expression wurde mit entzündlichen Phänotypen und verhaltensweisen in Verbindung gebracht, die für die Tumorzellstreuung relevant sind, wodurch DOCK1 ein nützliches Ziel für mechanistische Studien in der Krebsbiologie und Immunologie darstellt.

DOCK 180 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DOCK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DOCK 180 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DOCK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DOCK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DOCK 180-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DOCK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DOCK 180-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DOCK 180-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DOCK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.