Dnmt2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420034-ACT

Trdmt1 kodiert Dnmt2, eine evolutionär konservierte Cytosin-5-Methyltransferase, die vor allem spezifische tRNAs (insbesondere an C38) und nicht primär genomische DNA methyliert. Dadurch unterstützt sie die Integrität von tRNAs, die Genauigkeit der Decodierung sowie die zelluläre Anpassung an Stress. Über die Regulation der RNA-Methylierung greift Dnmt2 in Signalwege der RNA-Prozessierung und der Translationskontrolle ein, die Proteostase und Wachstumsantworten beeinflussen. Eine veränderte TRDMT1/DNMT2-Aktivität wurde mit fehlregulierten RNA-Methylierungsprogrammen in Verbindung gebracht, die mit Tumorbiologie, Reaktionen auf Virusinfektionen und stressassoziierten zellulären Phänotypen zusammenhängen. In Mausmodellen bietet Trdmt1 ein gut handhabbares System zur Aufklärung epitranskriptomischer Mechanismen, die RNA-Modifikationen mit Zellzustandsübergängen und Genomstabilität koppeln.

Dnmt2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Trdmt1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Dnmt2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Trdmt1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Trdmt1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Dnmt2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Trdmt1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Dnmt2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Dnmt2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Trdmt1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.