DnaJC13 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411713-ACT

DNAJC13 codifica DnaJC13, un co-chaperone di tipo J-domain implicato nel traffico mediato da clatrina e nel riciclo endosomiale, dove contribuisce a coordinare il controllo qualità delle proteine con la dinamica delle vescicole. La proteina è associata alla rete retromer/WASH e partecipa a decisioni di smistamento che influenzano il turnover dei recettori, il riciclo delle proteine di membrana e il trasporto dall’endosoma al Golgi. Attraverso questi ruoli, DNAJC13 influisce sull’omeostasi della segnalazione e sui percorsi di proteostasi sensibili ai difetti di traffico. Studi genetici e funzionali hanno collegato un’attività alterata di DNAJC13 a processi rilevanti per la neurodegenerazione, inclusi disturbi della funzione endolisosomiale e della gestione delle proteine sinaptiche.

DnaJC13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DNAJC13 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DnaJC13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DNAJC13 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DNAJC13, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DnaJC13. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DNAJC13 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DnaJC13 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DnaJC13 nelle cellule tumorali con espressione di DNAJC13 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.