Plasmide CRISPR d'Activation (m) DNA pol ζ: sc-422655-ACT

Rev3l code la sous-unité catalytique de la polymérase ADN ζ (pol ζ), une polymérase spécialisée de la famille B, indispensable à la synthèse translésionnelle de l’ADN et à la tolérance des lésions qui bloquent la réplication. Dans les cellules de souris, pol ζ coopère avec REV1 et le PCNA modifié par ubiquitination dans le cadre de la réponse aux dommages de l’ADN, afin d’étendre l’amorce à partir d’extrémités présentant des mésappariements ou des dommages, favorisant ainsi la progression de la fourche de réplication en conditions de stress génotoxique. Cette activité influence les taux de mutagenèse et la stabilité du génome, reliant les voies régulées par Rev3l aux mécanismes qui façonnent l’accumulation de mutations au cours de la carcinogenèse et à la sensibilité cellulaire aux agents endommageant l’ADN. Comme la fonction de Rev3l se situe à l’interface entre la signalisation du stress réplicatif et le choix des voies de réparation, elle est largement étudiée dans des modèles d’instabilité génomique, de diversification immunitaire et de viabilité du développement.

DNA pol ζ Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Rev3l sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DNA pol ζ Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Rev3l dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Rev3l, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DNA pol ζ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Rev3l natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DNA pol ζ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DNA pol ζ dans les cellules tumorales présentant une expression de Rev3l silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.