DNA pol ζ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402579-ACT

REV3L codifica la subunità catalitica della DNA polimerasi ζ (pol ζ), una polimerasi specializzata nella sintesi di translesione che estende a partire da nucleotidi inseriti in opposizione a lesioni del DNA, sostenendo l’avanzamento della forcella replicativa in condizioni di stress genotossico. In coordinamento con REV7 (MAD2L2) e con la segnalazione mediata dall’ubiquitina alle forcelle bloccate, la pol ζ opera all’interno delle vie di tolleranza al danno al DNA che si interfacciano con le risposte allo stress replicativo e con la riparazione post-replicativa. Poiché la pol ζ è intrinsecamente soggetta a errori, l’attività di REV3L influenza il carico mutazionale e la stabilità del genoma, collegando la sua regolazione a processi quali la carcinogenesi e la resistenza a esposizioni che danneggiano il DNA in sistemi modello. Un’alterata funzione di REV3L influisce anche sulla progressione del ciclo cellulare e sulla segnalazione dei checkpoint modulando l’esito tra bypass della lesione e collasso della forcella.

DNA pol ζ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di REV3L senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNA pol ζ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus REV3L nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione REV3L, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNA pol ζ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus REV3L nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNA pol ζ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNA pol ζ nelle cellule tumorali con espressione di REV3L silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.