Plasmide CRISPR d'Activation (h) DNA pol ζ: sc-402579-ACT

REV3L code la sous-unité catalytique de l’ADN polymérase ζ (pol ζ), une polymérase spécialisée de synthèse translésionnelle qui prolonge l’ADN à partir de nucléotides insérés en regard de lésions de l’ADN, afin de permettre la progression de la fourche de réplication en conditions de stress génotoxique. En coordination avec REV7 (MAD2L2) et la signalisation par l’ubiquitine au niveau des fourches bloquées, pol ζ agit au sein des voies de tolérance aux dommages de l’ADN, à l’interface des réponses au stress réplicatif et de la réparation post-réplicative. Comme pol ζ est intrinsèquement peu fidèle, l’activité de REV3L influence la charge mutationnelle et la stabilité du génome, ce qui relie sa régulation à des processus tels que la carcinogenèse et la résistance à des expositions génotoxiques dans des systèmes modèles. Une altération de la fonction de REV3L affecte également la progression du cycle cellulaire et la signalisation des points de contrôle en modulant l’issue du contournement des lésions par rapport à l’effondrement des fourches.

DNA pol ζ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de REV3L sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DNA pol ζ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus REV3L dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription REV3L, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DNA pol ζ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus REV3L natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DNA pol ζ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DNA pol ζ dans les cellules tumorales présentant une expression de REV3L silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.