DNA pol ν CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406518-ACT

POLN kodiert die DNA-Polymerase ν (DNA pol ν), eine Polymerase der A-Familie, die über Translesions-DNA-Synthese und damit verbundene, reparaturassoziierte DNA-Syntheseschritte an der DNA-Schadentoleranz und der Aufrechterhaltung des Genoms beteiligt ist. Die Aktivität von DNA pol ν wird mit der Verarbeitung von Läsionen in Verbindung gebracht, die replizierende Polymerasen zum Stillstand bringen, und beeinflusst damit das Vorankommen der Replikationsgabel sowie das Gleichgewicht zwischen fehleranfälligen und fehlerfreien DNA-Reparaturergebnissen. Als Teil umfassenderer DNA-Reparatur- und Replikationsstress-Antwortwege trägt POLN dazu bei, unter genotoxischem Stress die chromosomale Stabilität zu erhalten. Eine fehlregulierte POLN-Expression oder -Funktion wurde mit Mutagenese und Phänotypen der Genominstabilität assoziiert, die für mechanistische Untersuchungen krebsassoziierter DNA-Reparaturdefekte relevant sind.

DNA pol ν Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DNA pol ν Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DNA pol ν-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DNA pol ν-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DNA pol ν-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.