Plasmide CRISPR d'Activation (h) DLD: sc-403207-ACT

Le gène humain DLD code la dihydrolipoamide déshydrogénase, une oxydoréductase dépendante du FAD qui agit comme sous-unité E3 commune aux complexes pyruvate déshydrogénase, α‑cétoglutarate déshydrogénase et déshydrogénase des α‑cétoacides à chaîne ramifiée dans les mitochondries. En réoxydant la dihydrolipoamide et en transférant des électrons au NAD+, DLD contribue à maintenir la production d’acétyl‑CoA, le flux du cycle de l’acide tricarboxylique (cycle de Krebs) et l’équilibre rédox mitochondrial. Cette activité relie le catabolisme des glucides et des acides aminés à la phosphorylation oxydative ainsi qu’au contrôle des espèces réactives de l’oxygène. Une altération de la fonction de DLD est associée à un dysfonctionnement métabolique mitochondrial et à des phénotypes de maladies neurométaboliques, ce qui en fait un nœud pertinent pour l’étude de l’homéostasie énergétique et de la signalisation dépendante du rédox.

DLD Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DLD sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DLD Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DLD dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DLD, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DLD. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DLD natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DLD au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DLD dans les cellules tumorales présentant une expression de DLD silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.