Dia 2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403238-ACT

DIAPH2 (Dia 2) kodiert ein diaphanous-verwandtes Formin, das die Nukleation und Verlängerung von Aktinfilamenten reguliert und so zum Umbau des Zytoskeletts, zur Zellpolarität und zur Zytokinese beiträgt. Als Effektor in Rho-GTPase-gekoppelten Signalwegen unterstützt DIAPH2 Prozesse wie Zellmigration und -adhäsion, indem es die Aktindynamik mit Membrantransport und dem Crosstalk mit Mikrotubuli koordiniert. Veränderte DIAPH2-Aktivität und -Gendosis wurden im Kontext der Reproduktionsbiologie und des Verhaltens von Tumorzellen untersucht, wo die Kontrolle des Zytoskeletts die chromosomale Stabilität und invasive Phänotypen beeinflusst. In der biomedizinischen Forschung wird DIAPH2 häufig untersucht, um Rho-Formin-Signalwege mit Morphogenese, Zellzyklusprogression und Mechanotransduktion zu verknüpfen.

Dia 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DIAPH2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Dia 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DIAPH2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DIAPH2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Dia 2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DIAPH2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Dia 2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Dia 2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DIAPH2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.