Plásmido CRISPR de Activación (h) DGK-κ: sc-410308-ACT

DGKK codifica la diacilglicerol quinasa kappa (DGK-κ), una quinasa de lípidos que fosforila el diacilglicerol para generar ácido fosfatídico, moldeando así la dinámica de la señalización mediada por segundos mensajeros. Al controlar el equilibrio entre efectores dependientes de DAG y de PA, DGK-κ influye en las salidas de señalización vinculadas a PKC y a Ras/MAPK, con efectos posteriores sobre el tráfico de membranas, la remodelación del citoesqueleto y los programas transcripcionales. La actividad de DGKK se ha asociado con procesos celulares relevantes para la fidelidad de la transducción de señales en contextos inmunitarios y epiteliales, y la señalización alterada de la familia DGK se estudia con frecuencia en relación con la proliferación desregulada y la señalización inflamatoria. DGKK también se investiga por su contribución a alteraciones asociadas a enfermedades en redes de señalización lipídica, incluidas vías conectadas con la señalización oncogénica y la regulación inmunitaria.

DGK-κ El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DGKK sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DGK-κ El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DGKK en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DGKK, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DGK-κ. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DGKK y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DGK-κ en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DGK-κ en células tumorales con expresión de DGKK silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.