Plasmide CRISPR d'Activation (h) DEPP: sc-409806-ACT

C10orf10 code la protéine déciduale induite par la progestérone (DEPP), un facteur sensible au stress, induit en conditions d’hypoxie et de limitation en nutriments, et associé à la régulation du stress oxydatif ainsi qu’à des programmes liés à l’autophagie. L’expression de DEPP a été reliée à des voies d’adaptation cellulaire qui recoupent la signalisation métabolique et l’homéostasie rédox, notamment via la modulation des espèces réactives de l’oxygène et la survie en conditions de faible oxygénation. Des variations des niveaux de DEPP ont été rapportées dans divers contextes impliquant le remodelage tissulaire et l’inflammation, et sa dérégulation a été étudiée dans des travaux portant sur la biologie tumorale et les mécanismes des maladies métaboliques. Ces caractéristiques font de DEPP une cible utile pour étudier le contrôle transcriptionnel de l’adaptation au stress et les phénotypes en aval, tels que le flux autophagique, la fonction mitochondriale et la viabilité cellulaire.

DEPP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de C10orf10 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DEPP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus C10orf10 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription C10orf10, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DEPP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus C10orf10 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DEPP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DEPP dans les cellules tumorales présentant une expression de C10orf10 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.