dendrin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404856-ACT

Das humane DDN kodiert Dendrin, ein mit der postsynaptischen Dichte assoziiertes Protein, das in Neuronen angereichert ist und an der Organisation synaptischer Signalkomplexe beteiligt ist. Dendrin wirkt an der aktivitätsabhängigen Umgestaltung dendritischer Spines mit und wird mit der Regulation des Zytoskeletts sowie Protein-Protein-Interaktionen in Verbindung gebracht, die die synaptische Plastizität prägen. Über das ZNS hinaus wurde Dendrin in glomerulären Podozyten untersucht, wo es in schlitzdiaphragma-assoziierten Kompartimenten lokalisiert und mit Signalwegen verknüpft ist, die Zellstruktur und Stressantworten beeinflussen. Eine Fehlregulation der Dendrin-Expression oder -Lokalisation wurde im Zusammenhang mit neuropsychiatrischen Phänotypen und mit Prozessen bei Nierenschädigung untersucht, was seinen Wert als Forschungsziel für Mechanismen der Synapse und der Integrität der Filtrationsbarriere unterstreicht.

dendrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DDN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

dendrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DDN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DDN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen dendrin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DDN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von dendrin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des dendrin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DDN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.