DDIT3/CHOP/GADD153 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400051-ACT

DDIT3, auch bekannt als CHOP/GADD153, kodiert einen stressinduzierbaren bZIP-Transkriptionsfaktor, der Signale aus der Unfolded-Protein-Response und der integrierten Stressantwort zusammenführt. Es wird während des endoplasmatischen-Retikulum-Stresses stark über den PERK–eIF2α–ATF4-Signalweg induziert und moduliert Transkriptionsprogramme, die Apoptose, Autophagie, Redox-Gleichgewicht und Zellzyklusregulation steuern. DDIT3 beeinflusst, ob Stress adaptiv bewältigt wird oder in einen terminalen Verlauf übergeht, indem es die Expression von Genen verändert, die an Protein-Faltung, Aminosäurestoffwechsel und mitochondrialer Funktion beteiligt sind. Eine dysregulierte DDIT3-Signalgebung wurde mit dem Überleben von Krebszellen unter proteotoxischem Stress, mit metabolischen und neurodegenerativen Stress-Phänotypen sowie mit onkogenen Fusionsereignissen wie FUS–DDIT3 beim myxoiden Liposarkom in Verbindung gebracht.

DDIT3/CHOP/GADD153 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DDIT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DDIT3/CHOP/GADD153 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DDIT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DDIT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DDIT3/CHOP/GADD153-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DDIT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DDIT3/CHOP/GADD153-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DDIT3/CHOP/GADD153-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DDIT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.