Plasmide CRISPR d'Activation (h) DBC-1: sc-403056-ACT

CCAR2 code Deleted in Breast Cancer 1 (DBC-1), une protéine régulatrice nucléaire qui module des programmes transcriptionnels en interagissant avec des facteurs associés à la chromatine et des capteurs métaboliques. DBC-1 influence la signalisation dépendante de l’acétylation via la régulation de l’activité des sirtuines et coopère avec des récepteurs nucléaires ainsi qu’avec des corégulateurs transcriptionnels pour façonner le contrôle du cycle cellulaire, les réponses aux dommages de l’ADN et l’expression de gènes liés à l’apoptose. Par ces fonctions, CCAR2/DBC-1 est associé à des voies qui gouvernent la stabilité du génome et l’adaptation au stress, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude du remodelage transcriptionnel associé aux tumeurs et de la sénescence cellulaire. Une expression altérée de CCAR2 ou des réseaux d’interaction de DBC-1 modifiés ont été rapportés dans de multiples contextes cancéreux, et cette protéine suscite aussi un intérêt pour l’étude du dialogue métabolisme–épigénétique dans les cellules humaines.

DBC-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCAR2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DBC-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCAR2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCAR2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DBC-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCAR2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DBC-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DBC-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de CCAR2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.