DARPP-32 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400430-ACT

PPP1R1B kodiert DARPP-32 (dopamin- und cAMP‑reguliertes Phosphoprotein mit 32 kDa), einen zentralen Integrator dopaminerger und glutamaterger Signalübertragung in Neuronen. Wird DARPP-32 durch PKA phosphoryliert, hemmt es die Proteinphosphatase 1 und moduliert dadurch nachgeschaltete Phosphorylierungszustände, die synaptische Plastizität, Transkriptionsantworten und die neuronale Erregbarkeit prägen. Diese Regulation verknüpft PPP1R1B mit cAMP/PKA‑Signalgebung, calciumabhängigen Signalwegen und rezeptorgetriebenen Phosphorylierungsnetzwerken in striatalen medium spiny neurons (mittelgroßen stacheligen Projektionsneuronen). Eine veränderte DARPP-32‑Expression oder -Phosphorylierung wird häufig im Kontext neuropsychiatrischer und neurodegenerativer Krankheitsmechanismen sowie von Veränderungen der Signaltransduktion in der Tumorbiologie untersucht.

DARPP-32 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPP1R1B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DARPP-32 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPP1R1B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPP1R1B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DARPP-32-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPP1R1B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DARPP-32-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DARPP-32-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPP1R1B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.