Plásmido CRISPR de Activación (h) DARPP-32: sc-400430-ACT

PPP1R1B codifica DARPP-32 (fosfoproteína de 32 kDa regulada por dopamina y AMPc), un integrador clave de la señalización dopaminérgica y glutamatérgica en neuronas. Cuando es fosforilada por PKA, DARPP-32 inhibe la fosfatasa de proteínas 1, modulando así estados de fosforilación aguas abajo que determinan la plasticidad sináptica, las respuestas transcripcionales y la excitabilidad neuronal. Esta regulación vincula a PPP1R1B con la señalización AMPc/PKA, las vías dependientes de calcio y las redes de fosforilación impulsadas por receptores en las neuronas espinosas medianas del cuerpo estriado. La alteración de la expresión o la fosforilación de DARPP-32 se estudia con frecuencia en el contexto de los mecanismos de enfermedades neuropsiquiátricas y neurodegenerativas, así como de cambios en la transducción de señales en biología tumoral.

DARPP-32 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PPP1R1B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DARPP-32 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PPP1R1B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PPP1R1B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DARPP-32. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PPP1R1B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DARPP-32 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DARPP-32 en células tumorales con expresión de PPP1R1B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.